一、CETSA：细胞热位移分析技术
摘要
在活细胞生理环境下直接验证药物与靶点的特异性结合，是药物研发从体外筛选走向临床转化的关键环节。细胞热位移分析技术（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）突破传统分子互作技术依赖纯化蛋白、脱离生理环境的局限，实现活细胞及组织内靶点蛋白-配体相互作用的直接、原位、定量检测。
01. CETSA技术原理
CETSA技术基于配体结合改变蛋白质热稳定性的核心原理，实现活细胞内靶点蛋白-配体相互作用的直接检测。蛋白质在生理温度下维持天然构象，当温度升高时会发生热变性、聚集并沉淀；而当靶点蛋白与特异性配体（药物、小分子、多肽等）结合后，其构象稳定性显著提升，热变性温度（Tm）向高温方向偏移。
技术通过梯度加热处理细胞/组织样本，使未结合配体的靶点蛋白发生热变性沉淀，而结合配体的靶点蛋白保持可溶性；随后通过离心分离可溶性蛋白与变性沉淀，利用Western Blot、质谱或荧光定量等方法检测可溶性靶点蛋白的含量，绘制热位移曲线（Melting Curve），计算Tm值偏移量（ΔTm），从而定量评估配体与靶点在活细胞内的结合亲和力与特异性。
02. CETSA标准化实验流程
（一）样品处理与药物处理
- 细胞培养：将目标细胞接种于培养皿，培养至对数生长期，设置药物处理组与对照组（DMSO溶剂对照）
- 组织样本：取动物组织或临床穿刺组织，剪碎后匀浆，加入药物孵育
- 孵育条件：37℃孵育1-4小时，确保药物充分穿透细胞膜并与靶点结合
（二）梯度加热与蛋白分离
- 梯度加热：将处理后的细胞/组织样本分装至PCR管，设置梯度温度（通常37℃-80℃，间隔3-5℃）
- 快速裂解与离心：加热后立即冰浴冷却，加入细胞裂解液，反复冻融裂解细胞
- 蛋白定量：采用BCA法测定上清液中总蛋白浓度
（三）靶点蛋白检测
- 经典CETSA：采用Western Blot检测上清液中靶点蛋白的表达量
- MS-CETSA：将上清液进行酶解、标记，通过高分辨质谱进行全蛋白质组检测
03. CETSA核心优势
- 生理原位检测：直接在活细胞、组织内检测，保留细胞膜、细胞器及蛋白复合物等生理微环境
- 无需蛋白纯化：突破传统技术依赖纯化蛋白的瓶颈，适用于膜蛋白、难纯化蛋白、核蛋白等复杂靶点
- 全局靶点筛选：MS-CETSA可实现全蛋白质组无偏向性筛选，同时鉴定靶点与脱靶蛋白
- 特异性强：通过热位移与浓度依赖性双重验证，有效排除假阳性结果
04. 典型应用案例
（一）抗肿瘤药物靶点验证
在靶向KRASG12C的小分子药物研发中，采用CETSA技术验证药物与靶点的细胞内结合。结果显示药物处理组Tm值较对照组提升6.8℃，且呈现浓度依赖性，EC50=125nM，明确药物在活细胞内特异性结合KRASG12C靶点。
（二）天然产物靶点发现
采用MS-CETSA技术筛选中药活性成分黄芩苷的潜在靶点，对肝癌细胞进行药物处理与全蛋白质组热位移分析，共鉴定出18个发生热位移的蛋白。
二、LiP-MS：有限蛋白酶解-质谱联用技术
摘要
有限蛋白酶解-质谱联用（LiP-MS）是结构蛋白质组学领域非标记、高通量、原位构象解析核心技术，通过蛋白酶K温和酶切与高分辨质谱定量，实现复杂体系中蛋白质构象动态与相互作用的精准表征。
01. LiP-MS技术原理
LiP-MS以蛋白质构象决定酶切可及性为核心：天然态下，蛋白质表面柔性区域易被广谱非特异性蛋白酶K（PK）快速切割；当蛋白与小分子结合、发生翻译后修饰或蛋白-蛋白相互作用时，局部构象收紧/舒展，改变切割位点暴露程度，形成特征性肽段丰度差异。
技术路径：温和有限酶切→完全酶解→肽段富集→LC-MS/MS定量→构象差异肽段筛选→靶标与位点解析。不依赖化学修饰、无需蛋白纯化，原位保留生理构象。
02. 标准化实验流程
- 样品制备：细胞裂解液/组织匀浆/体液样本，BCA定量，设处理组与对照组
- 有限蛋白酶解（LiP）：PK酶底比1:100（wt/wt），25℃孵育5 min，99℃ 5 min灭活
- 肽段制备：DTT还原、IAA烷基化，胰酶过夜酶解；C18 SPE除盐
- 质谱采集：Orbitrap高分辨质谱，DIA模式；分辨率120K、质量精度<3 ppm
- 质控与重复性：RSD<15%、肽段鉴定率>85%
03. 结果与数据分析
- 通量：单次鉴定~3500蛋白、~40000肽段，覆盖度较传统结构方法提升3–5倍
- 灵敏度：构象响应检出限低至nM级，样本用量仅为标记法1/10
- 特异性：假阳性率<5%，位点定位精度达氨基酸水平
- 重复性：生物学重复相关系数R²>0.95，技术重复R²>0.98
04. LiP-MS核心技术优势
- 非标记原位解析：不修饰、不纯化，保留生理构象，避免活性干扰
- 高通量全景覆盖：单次实验并行监测数千蛋白构象，无偏向性
- 高灵敏度与微量适配：适合临床微量样本（脑脊液、穿刺组织）
- 位点级精准定位：直接给出结合/变构区域，支撑机制与分子设计
- 广谱适用性：适用于原核/真核、纯化蛋白/复杂组学、体外/原位体系
05. 典型应用案例
药物靶点发现与验证
小分子处理细胞后，LiP-MS筛选出12个显著构象变化蛋白，经共纯化、SPR、分子对接验证，确证2个全新靶标，命中率提升40%，周期缩短60%。
疾病生物标志物开发
临床组织样本中，鉴定23个疾病特异性构象肽，构建诊断模型，AUC=0.92，优于传统丰度标志物（AUC=0.78）。
LiP-MS/CETSA非标记法钓靶技术示意图